【基本原理】

通常情况下，细胞骨架不稳定，如低温、高压、饥饿酸处理等。当浓度适当时TritonX-100 在处理细胞时，可溶解质膜结构和细胞中的许多蛋白质，而细胞骨架系统中的蛋白质不被破坏显得更清晰，M-用缓冲液清洗细胞可以提高细胞骨架的稳定性。戊二醛固定可以更好地保存细胞骨架的成分R250 染色后，细胞骨架蛋白可以着色，而细胞背景着色较弱，有利于细胞骨架纤维的显示。

微丝、微管和中间纤维直径小，*大的单根微管25nm 只能在电镜下观察到。目前，研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微镜技术。本实验用普通光镜观察细胞骨架，因为骨架纤维的成束分布和结构被染色。因为细胞通过TritonX-100 提取后剩余的主要是细胞骨架成分，使显示更加清晰。细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，根据成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们在维持细胞形态、生长、运动、分裂、分化和物质运输方面发挥着重要作用。Triton X-100 可以溶解细胞膜，保存细胞骨架系统的蛋白质，然后使用考马斯亮兰R250 染色使细胞骨架清晰显现。

【实验用品】

1材料：新鲜洋葱鳞茎

2试剂 1) M 缓冲液（pH 7.2）各成分的*终浓度为：

50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)；

0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；

0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)

2） 6mmol/L PBS 磷酸缓冲液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:3

3） 0.7% NaCl 生理盐水

4） 1% Triton X-100 溶于 M-缓冲液

5） 3% 戊二醛100mL: 取25% 戊二醛12mL，PBS 88mL

6） 0.2% 考马斯亮蓝R250 染液 200mL：考马斯亮蓝R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸馏水46.5mL

3仪器：光学显微镜、镊子、剪刀、试管、表面容器、滴管、玻片盖

方法步骤

【实验结果】

与内表皮细胞相比(放大倍数)10×20）

附件：各种主要试剂的作用

1．Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用:非离子去垢剂；浓度适当的Triton X-100，细胞膜可以溶解，细胞质中的细胞骨架系统可以保存。

2．M－缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压。

3．EDTA(乙二胺四乙酸)和EGTA(乙二醇双醚四乙酸)作用:前者可螯合大部分金属离子；后者是专用螯合Ca2+，主要是高浓度Ca2+但是微管解聚，所以加入EGTA 来降低Ca2＋的浓度。

4。戊二醛功能：良好的固定剂，使细胞结构保持原状；

5考马斯亮兰功能：非专一性与蛋白质结合，使蛋白质着色(蓝色)。